类器官消化是类器官培养中的关键步骤，因其复杂的细胞结构和多样的细胞类型，使得类器官消化不同于普通细胞一样容易进行，消化不下来、离心后没有沉淀等，这些常见问题应该如何解决呢？接下来就让我们一起看看吧！

01 什么时候可以进行消化？

类器官消化的时机很重要。消化时机过早、过晚都不利于类器官继续生长。

类器官大小：当类器官直径达到200-500 μm或类器官生长速度明显减慢时，通常需要传代。

培养基消耗：培养基变黄，说明需要传代。

类器官结构变化：如果类器官结构开始变得不规则或出现中心坏死，应尽快传代。

类器官脱落：部分类器官和细胞从Matrigel基质中脱落，漂浮在培养基中，需要传代。

细胞过度迁移覆盖基质胶：细胞已经完全覆盖了基质胶的边缘，甚至整个培养皿底部都被迁移的类器官细胞占据，导致基质胶难以被观察到。这可能提示细胞的迁移能力过强，或者培养环境促使细胞过度生长和扩散，需要传代。

02 出现这些问题如何解决？

01 消化不下来

类器官在消化后仍然存在较大的细胞团块，无法完全解离成单细胞悬液。

原因分析：

消化酶不发挥作用：消化酶的浓度、活性或作用时间不足，消化过程中温度、pH值等条件控制不当，无法有效降解类器官中的细胞外基质（ECM）和细胞间连接。

类器官成分复杂：不同来源的类器官细胞外基质成分差异较大，某些成分对消化酶的敏感性较低，导致消化困难。

解决方法：

根据类器官的类型和来源，选择合适的消化酶。对于富含胶原蛋白的类器官，可以使用胶原酶；对于干细胞含量较高的类器官，建议使用温和的中性蛋白酶。

对于成分复杂的类器官，可以采用分步消化的方法。先用一种酶进行初步消化，去除部分细胞外基质，再用另一种酶进行进一步消化，逐步解离细胞。

确保消化过程中的温度、pH值等条件符合酶的最佳活性范围。根据实验需求合理调整消化时间，避免消化不足或过度。

02 离心后无沉淀

正常离心后应该分为缓冲液、基质胶和类器官沉淀三层，但实际操作中有时会出现这种情况，基质胶和类器官沉淀形成混悬液，无法完全分离。

原因分析：

类器官数量少，体积小，降温时间不够，基质胶粘稠等。

解决方法：

加尽可能多的缓冲液，稀释基质胶类器官混合物，能促进分离。

将基质胶类器官混合物放于-20℃，5min（注意：如果冰箱冷冻效果强，冷冻3min），加速基质胶液化，能促进分离。

离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离。

离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

如果按照上述方法改善基质胶和类器官仍未分离，可保留基质胶类器官混悬物下2/3传代（上1/3基本是原代细胞杂质或死细胞）。

03 细胞陷入“僵持”状态

细胞消化后培养处于一种“僵持”状态，既无法正常增殖，也难以死亡。

原因分析：

如果使用的胰蛋白酶、胶原酶等消化酶浓度过高，可能会对细胞造成过度损伤，例如，胰蛋白酶浓度过高会破坏细胞表面的蛋白质结构，影响细胞的附着和生长信号传导。消化时间过长，也会使细胞表面的受体和黏附分子过度降解，影响类器官正常生长。操作过程中的机械损伤也有可能导致此类情况发生。

解决方法：

根据类器官的来源细胞类型，选择合适的消化酶，并严格按照推荐浓度和作用时间进行操作。对于一些干细胞来源的类器官，可能需要使用低浓度的胰蛋白酶（如0.05%）来避免损伤。

在消化过程中，吹打力度要轻柔。避免使用过大的力量吹打细胞，以免产生剪切力损伤细胞。

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